在免疫印迹、免疫组化等分子生物学实验中，TBST缓冲液是实验成功的关键因素之一。作为一种常用且重要的生化试剂，TBST在维持蛋白质稳定性、减少非特异性结合方面发挥着不可或缺的作用。本文将全面解析TBST缓冲液的组成原理、应用场景及实验技巧，帮助科研工作者更好地理解和运用这一重要试剂。

1 TBST缓冲液的基本定义与组成

TBST缓冲液是Tris-Buffered Saline with Tween-20的缩写，顾名思义，它是由Tris缓冲液、氯化钠（NaCl）和Tween-20这三种基本成分组成的水溶液。

Tris是一种有机化合物，全称为三羟甲基氨基甲烷，它在TBST中的主要作用是维持溶液的pH稳定性。通常TBST的工作pH值设置在7.2-7.6之间，接近生理pH环境，这对于保持生物分子的天然结构和功能至关重要。

氯化钠则提供了一定的离子强度和渗透压，使TBST成为等渗溶液，类似于生物体内的生理条件，这有助于维持蛋白质的稳定性和活性。

Tween-20是一种非离子型表面活性剂，在TBST中通常使用浓度为0.05%-0.1%。它的主要功能是降低表面张力，作为去污剂可增加缓冲液的洗脱能力，帮助洗去非特异性结合的分子。

这三种成分的协同作用使得TBST成为一种理想的实验缓冲液，既能维持生物分子的稳定性，又能有效降低背景噪音，提高实验的信噪比。

2 TBST在科研实验中的主要应用

2.1 免疫印迹（Western Blotting）

在Western Blotting实验中，TBST是使用频率最高的缓冲液之一，贯穿多个实验步骤：

• 膜封闭：转移完成后，膜需要用封闭液（如5%脱脂奶粉或BSA）进行封闭，而这些封闭剂通常都是用TBST稀释的。
• 抗体孵育：一抗和二抗的稀释常用TBST作为基础溶液，它能保持抗体的稳定性同时减少非特异性结合。
• 膜清洗：在各步骤之间，膜需要用TBST清洗，以去除未结合的抗体，减少背景干扰。

特别需要注意的是，在选择封闭剂时，脱脂奶粉虽然经济易得，但其中含有的生物素和磷酸化蛋白可能会干扰某些检测，在这种情况下应使用BSA作为封闭剂。

2.2 免疫组织化学（IHC）

在免疫组织化学实验中，TBST同样发挥着重要作用。它常用于清洗步骤，去除未特异性结合的一抗或二抗，降低背景染色。

此外，TBST也常用于稀释一抗，因为它能模拟免疫系统相互作用的自然环境中抗体和抗原遭遇的条件——等渗压和生理pH值，这有助于抗原-抗体的特异性结合。

2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）

在ELISA实验中，TBST主要用于板孔的清洗步骤，有效去除未结合的蛋白质或抗体，减少非特异性结合，提高实验的准确性和灵敏度。

与其他缓冲液相比，TBST中的Tween-20能更好地改善缓冲液的洗脱能力，这对于获得低背景、高信噪比的实验结果至关重要。

3 TBST的配制方法与注意事项

3.1 标准配制方法

TBST缓冲液可以有1×或10×、20×等浓缩形式，以下是1×TBST的参考配制方法：

• 氯化钠：8.0g（最终浓度约为137mM）
• Tris-HCl（pH7.4-7.6）：适量（最终浓度约为20-50mM）
• Tween-20：0.5-1mL（最终浓度为0.05%-0.1%）
• 加蒸馏水至1000mL

实际配制时，可先溶解NaCl，加入Tris-HCl缓冲液，最后加入Tween-20，搅拌均匀后定容至最终体积。

3.2 配制与使用注意事项

1. pH调整：TBST的pH值通常调整在7.2-7.6之间，需要注意的是Tris的pH值会随温度变化，因此在溶液达到预定温度后应重新检查并调整pH值。
2. 保存条件：配制好的TBST缓冲液在室温下可稳定保存6个月，但4℃冷藏可延长保质期。若出现结晶析出，只需37℃水浴至完全溶解即可使用。
3. 混合均匀：加入Tween-20后应充分混合，因为Tween-20是粘稠液体，不易均匀分散。
4. 过滤除菌：对于要求严格的实验，建议使用前用0.45μm滤膜过滤，去除可能存在的微粒杂质。

4 TBST与PBST的比较与选择

在实验室中，PBST是另一种常用的缓冲液，它与TBST的主要区别在于缓冲体系：PBST使用磷酸盐缓冲液，而TBST使用Tris-HCl缓冲液。

两者在选择上有以下考量：

• pH稳定性：TBST的pH值受温度影响较大，而PBST在常温下pH更稳定，但容易产生沉淀。
• 应用范围：对于碱性磷酸酶（AP）标记的抗体，推荐使用TBST，因为PBS可能会干扰AP信号。
• 抗体兼容性：如需反复使用稀释的抗体，通常建议使用TBST稀释，因其更有利于抗体稳定性的保持。

总的来说，TBST和PBST在多数情况下可以互换使用，但根据具体的实验体系和需求做出适当选择至关重要。

5 TBST使用中的常见问题与解决方案

5.1 高背景问题

如果在Western Blot或IHC实验中出现高背景，可能源于TBST的使用不当：

• Tween-20浓度不足：确保TBST中Tween-20的浓度在0.05%-0.1%范围内，浓度过低会导致清洗效果不佳。
• 清洗时间不足：每次清洗应保证足够的时间（通常5-10分钟）和足够的清洗次数（通常3-5次）。
• 封闭不充分：尝试更换封闭剂（从脱脂奶粉换为BSA或反之），或提高封闭剂浓度。

5.2 信号弱问题

如果实验信号过弱，可以考虑以下方面：

• Tween-20浓度过高：过高的Tween-20浓度可能会洗脱特异性结合的抗体，可适当降低浓度至0.05%。
• 缓冲液污染：检查TBST是否被微生物污染，配制时间过长的TBST应避免使用。

5.3 膜干燥问题

在清洗过程中，需确保膜始终处于湿润状态，避免干燥造成的蛋白变性和高背景。使用足够的TBST完全覆盖膜，并在摇床上缓慢晃动以确保清洗均匀。

6 结语

TBST缓冲液作为分子生物学和免疫学研究中的基础试剂，其正确理解和应用对实验成功至关重要。从Western Blot到IHC，从ELISA到各种蛋白质分析实验，TBST都发挥着不可替代的作用。掌握TBST的配制原理、使用技巧和疑难排解，不仅能帮助科研人员获得更可靠、更清晰的实验结果，也能深化对生物分子相互作用的理解。随着科学技术的不断发展，TBST这一经典缓冲液将继续在生命科学研究中扮演重要角色。

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