FLAG标签洗脱难？3X FLAG peptide竞争洗脱

1. 3X FLAG peptide 是什么、用在哪？

货号 abs45131801 的 3X FLAG peptide（别名 Triple FLAG）是合成的、含三个重复 DYKXXD 氨基酸序列的多肽，常用于竞争性结合 Anti-FLAG 抗体。CAS 402750-12-3，分子式 C120H169N31O49S，分子量 2861.91，纯度 95%，冻干粉形式，以 TFA 盐形式提供。完整序列为 H-Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp-Gly-Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp-Ile-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-OH，来源为化学合成。

2. 3X FLAG peptide 怎么洗脱标签蛋白？

标准流程分四步。质粒转染：把 FLAG 标记的 mIRS-1、hIRS-1 或突变体质粒转入 293T 细胞，转染 2 天。收集细胞：4℃ 下 14,000 rpm 离心 10 分钟，用 HEPES 缓冲液裂解。磁珠纯化：裂解液中加入 Anti-FLAG 磁珠（1 μm），室温孵育 2 小时或 4℃ 过夜，洗涤后用含 1 mg/mL 3X FLAG 的缓冲液洗脱，再经凝胶过滤纯化、浓缩后分装于 -80℃。洗脱浓度 1 mg/mL 是关键参数，低于此值洗脱往往不彻底。

3. 3X FLAG peptide 用于 Co-IP 与质谱怎么操作？

Co-IP 与 co-IP-MS 的洗脱条件与纯化不同：细胞裂解液先以 13,300 rpm、4℃ 离心 15 分钟去除完整细胞；上清用对照 IgG 或一抗在免疫沉淀缓冲液中过夜孵育，再与 20 μL 重悬的 A/G 蛋白珠在 4℃ 孵育 2 小时沉淀结合蛋白。连续免疫沉淀时，用 5 倍凝胶体积的 3X FLAG 洗脱溶液（终浓度 150 μg/mL）在 4℃ 孵育 2 小时从珠上洗脱，随后做 WB；或者跑 SDS-PAGE、染色、切胶、脱色、胰酶消化后做液相色谱-质谱鉴定。注意这里洗脱浓度是 150 μg/mL，比纯化用的 1 mg/mL 低，两套条件别混用。

4. 3X FLAG peptide 溶解储存注意什么？

溶解度双路线都可走：水中 33.33 mg/mL，DMSO 中 10 mg/mL。储存要求比常规化合物严格，需密封、防潮。粉末 -80℃ 可存 2 年、-20℃ 存 1 年；溶解后 -80℃ 6 个月、-20℃ 仅 1 个月，干冰运输。多肽容易吸潮降解，收到后先按单次用量分装再冻存。

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