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一、RNA提取
1、样本裂解：
组织样本： Trizol用量：每 50-100 mg 组织加 1 mL Trizol，样品体积不应超过 Trizol 体积的 10％。
（1）将动物或植物组织切成小块，在液氮中磨碎或用匀浆器匀浆处理。
（2）将研磨好的组织粉末快速转入装有 1 mL Trizol 的 2 mL 离心管中，在涡旋振荡器上迅速振荡混匀，置于冰上， 待所有的样品研磨完。
（3）裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体。对于富含蛋白、脂肪或多糖物质的组织样品如肌肉、脂肪组织和植物结节部位等，匀浆后仍会存留有不溶物质，可于 4℃ 12,000 x g 离心 10 min，然后吸取上清至一新的离心管中。
细胞样本：
（1）贴壁细胞：吸尽培养液，每 10 cm2培养面积（6 孔板单孔或 35 mm 平皿）加入 1 mL Trizol，用加样器吹打数次，以确保细胞完全裂解，然后转移至离心管中。 注：Trizol 的使用量应由培养皿表面 积决定，而非由细胞数目决定。Trizol 量不足可能导致提取的 RNA 中有 DNA 污染 。
（2）悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每 5-10×106动植物或酵母细胞，或每 1×107细菌细胞加入 1mL Trizol， 用加样器吹打，使其完全裂解，然后转移至离心管中。 注：添加 Trizol 前切勿洗涤细胞 ，以免 RNA 降解。必要时可以用匀浆器来裂解某些细菌或者酵母细胞 。
2、液相分离：
（1）裂解产物于室温放置 5 min，使核酸-蛋白复合物完全分离。（注：此时样品可在-80℃长期保存。 ）
（2）每 1 mL Trizol 加入 0.2 mL 氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡 15 s，室温放置 2-3 min。
（3）4℃ 12,000 x g 离心 15 min，样品会分成三层：桔黄色的下层有机相，中间层和无色的上层水相。
（4）吸取含总 RNA 的上层水相至一新的离心管中，吸取水相的体积为所用 Trizol 试剂的 60％。
3、RNA 回收
（1）按照每 1 mL Trizol 的最初使用量加入 0.5 mL 异丙醇，颠倒数次混匀，室温放置 10 min。
（2） 4℃ 12,000 x g 离心 10 min，弃除上清，可见胶状的 RNA 沉淀。
（3）按照每 1 mL Trizol 的最初使用量加入 1 mL 75%乙醇，颠倒数次混匀，洗涤沉淀。
（4）4℃ 12,000 x g 离心 5 min，弃除上清。
（5）室温倒置 5-10 min 晾干或真空抽干（不要使用真空干燥离心机，以免 RNA 过干，难以溶解）。
（6）加入适量（如 25uL） DEPC-ddH2O 或 TE 缓冲液，用加样器吹打数次溶解 RNA。
（7）通过 RNA 电泳以及紫外分光光度计检测，确定 RNA 的浓度、纯度和完整性。
（8）所得的 RNA 应立即使用或适量分装后-80℃保存，避免反复冻融。
产品推荐：
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货号
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产品名称
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规格
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abs60154
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Trizol
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100mL/500mL
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abs9331
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Trizol（总RNA抽提试剂盒）
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1kit
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abs9259
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无酶无菌水
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500mL
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二、逆转录
1、去除RNA中基因组DNA残留：
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组分
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体积
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RNA模板*
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≤ 1 ug total RNA 或≤ 0.1 ug poly(A) mRNA
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5×gDNA remover buffer
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2 uL
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gDNA remover
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1 uL
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Nuclease-free Water (DEPC-treated)
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补足至10 uL
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混匀，并短暂离心，反应条件为37℃，5 min。
* 采用自备的序列特异性引物时，RNA 模板的量可调整为“≤ 5 ug total RNA 或≤ 0.5 ug poly(A) mRNA”
2、在上述的反应管中，直接添加如下的反转录反应所需组分，进行第一链cDNA 的合成步骤：
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组分
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体积
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gDNA remover 处理后RNA 样品
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10 uL
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5 x Buffer (with primer)
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4 uL
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Enzyme mix
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1 uL
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Nuclease-free Water (DEPC-treated)
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补足至20 uL
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3、轻轻混匀，短暂离心；42℃孵育15-50 min。注意：复杂模板逆转录温度可升高至50℃，提高反转录效率。
反应时间可根据实验应用场景做适当调整。如合成的cDNA 用作qPCR 模板，则反应条件为42℃孵育15 min。
4、85℃加热5 min 失活Enzyme mix。
5、反应结束后所得的cDNA，请置于冰上进行后续实验或冷冻保存。
产品推荐：
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货号
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产品名称
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规格
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abs601510
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First-strand cDNA Synthesis Mix With gDNA Remover
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50T/100T/200T
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三、qPCR实验
染料法qPCR （以abs601511产品为例）
用户需自备的试剂：cDNA 或 DNA 模板、引物、ROX Reference Dye/ROX Reference Dye II。
请按照不同品牌荧光定量PCR仪的使用说明书要求进行实验操作。
操作示例：分别以20 μ l和50 μ l PCR反应体系为例：
1、PCR 反应体系的建立：
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组分
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20uL体系
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50uL体系
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DNA模板
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1uL
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1uL
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正向引物（10uM)
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0.5uL
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1uL
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反向引物（10uM)
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0.5uL
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1uL
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2×RealStar Green Fast Mixture
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10uL
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25uL
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ROX Reference Dye/ROX Reference Dye II
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0.4uL
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1uL
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RNase-free H2O
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补足至20uL
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补足至50uL
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注：
*模板量： 10-100 ng基因组DNA，或 1-10 ng cDNA 为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。 另外， Two Step RT-PCR 反应的cDNA（ RT 反应液）作为模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的10% 。
*引物：通常引物浓度以 0.2 μM 可以得到较好结果，可以终浓度 0.1-1.0 μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。为了获得理想的 qPCR 的效果，扩增片段的长度建议为 80-200 bp 。
*不同仪器所需 ROX Reference Dye不同，或需要添加或不需要添加，请根据仪器说明进行操作。
2、PCR 反应条件的设置： 本制品中使用的HotStart Taq DNA Polymerase是利用抗Taq抗体封闭的HotStart DNA聚合酶，如果在PCR反应 前进行模板的预变性，通常设定为95℃、2 min，复杂或高GC模板适当延长时间至5 min。该DNA聚合酶在15 s内可完成至 少300 bp的扩增，可以满足绝大多数的qPCR实验；对于超过350 bp或者高GC含量的扩增子，建议增加延伸时间至60 s或者采用三步法以提高扩增效率。
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两步法 PCR 扩增标准程序：
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预变性
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95℃
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2min
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40 Cycles
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变性
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95℃
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15s
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退火/延伸
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60℃
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15-30s
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溶解曲线（仪器自动设置）
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三步法 PCR 扩增程序：
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预变性
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95℃
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2min
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40 Cycles
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变性
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95℃
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15s
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退火
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60℃
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15-30s
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延伸
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72℃
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30s
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溶解曲线（仪器自动设置）
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注 ： 以上举例为常规 qPCR反应系统，仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异 ， 需根据模板、引物、目的片段的特点设定最佳反应条件，并根据比例放大或缩小反应体系。
3、在相应的 Real Time PCR 仪器上完成实验，并分析结果。
产品推荐：
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货号
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产品名称
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规格
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应用
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abs601511
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2×预混实时荧光定量快速PCR反应体系
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1.7mL×3
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染料法qPCR
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abs601512
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2×预混实时荧光定量快速PCR反应体系（高浓度ROX）
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1.7mL×3
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染料法qPCR
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abs601513
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2×预混实时荧光定量快速PCR反应体系（低浓度ROX）
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1.7mL×3
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染料法qPCR
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abs60305
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探针法荧光定量PCR试剂盒
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100T/200T/500T
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探针法qPCR
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abs60307
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探针法超级多重荧光定量PCR试剂盒
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100T/200T/500T
|
探针法qPCR
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耗材产品推荐：
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货号
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产品名称
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规格
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abs7089
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0.1mL PCR反应板（透明，半裙边）
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1箱
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abs7090
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0.1mL PCR反应板（透明，无裙边）
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1箱
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abs7091
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0.2mL PCR反应板（透明，半裙边）
|
1箱
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abs7092
|
0.2mL PCR反应板（透明，无裙边）
|
1箱
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abs7246
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荧光定量PCR封板膜（压敏强粘）
|
1盒
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abs7247
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荧光定量PCR封板膜（24/48孔，压敏）
|
1盒
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abs7248
|
PCR封板膜（强粘高透）
|
1盒
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abs7093
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100uL PCR 8连管（带盖）
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1箱
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abs7094
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200uL PCR 8连管（带盖）
|
1箱
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abs7119
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1.5mL离心管（无菌无酶）
|
1箱
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abs7118
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0.5mL离心管（无菌无酶）
|
1箱
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abs7071
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10uL滤芯吸头（盒装 无菌无酶）
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1箱
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abs7074
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200uL滤芯吸头（盒装 无菌无酶）
|
1箱
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abs7077
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1000uL滤芯吸头（盒装 无菌无酶）
|
1箱
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abs7176
|
20uL滤芯吸头（盒装 无菌无酶）
|
1箱
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abs7072
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10uL吸头（盒装 无菌无酶）
|
1箱
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abs7073
|
10uL吸头（袋装 无酶）
|
1箱
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abs7075
|
200uL吸头（盒装 无菌无酶）
|
1箱
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|
abs7076
|
200uL吸头（袋装 无酶）
|
1箱
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abs7078
|
1000uL加长吸头（盒装 无菌无酶）
|
1箱
|
|
abs7079
|
1000uL吸头（盒装 无菌无酶）
|
1箱
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|
abs7080
|
1000uL吸头（袋装 无酶）
|
1箱
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|
abs7081
|
1000uL加长吸头（袋装 无酶）
|
1箱
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Absin文献奖励重磅升级！
Absin产品线：
爆款产品：十大试剂盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化检测、残留检测、多因子检测)；细胞培养(类器官试剂盒+基质胶，胎牛血清+培养添加剂+细胞因子)、分化试剂盒；分子(mRNA合成服务+提取试剂盒)；化合物大包装；辅助试剂、耗材/仪器、定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...
特色产品：鸡胚提取物CEE、B27、N2、霍乱毒素B亚单位CTB、牛脑垂体提取物BPE、百日咳毒素PTX、重组人胰岛素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...
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