RNA表达研究通关秘籍：TriiZol+逆转录+荧光定量三件套手把手指南

在分子生物学实验室里，RNA表达分析堪称“基础中的基础”，从基因功能验证到疾病标志物筛选，几乎都离不开它的身影。但不少科研人都曾踩过坑：提的RNA降解严重、逆转录效率忽高忽低、荧光定量结果重复性差……其实，搞定这些问题的关键，就藏在TriiZol裂解提取、逆转录合成cDNA、荧光定量PCR（qPCR）检测这“三件套”里。今天就带大家吃透这套黄金组合的操作精髓，让你的RNA表达研究一路绿灯！

 

第一关：TriiZol法提取RNA——守住实验的“源头活水”

 

RNA天生“娇弱”，易被核酸酶降解，而TriiZol试剂凭借强大的裂解能力和核酸酶抑制效果，成为提取总RNA的“王牌选手”。无论是动物组织、植物样本还是细胞，它都能轻松应对，帮你拿到高质量RNA。

 

TriiZol（abs60154）标准操作PROTOCOL

 

1. 样本处理

 

组织样本：

TriiZol用量：每 50-100 mg 组织加 1 ml TriiZol，样品体积不应超过TriiZol体积的10％。

（1）将动物或植物组织切成小块，在液氮中磨碎或用匀浆器匀浆处理。

（2）将研磨好的组织粉末快速转入装有1 ml TriiZol 的 2 ml 离心管中，在涡旋振荡器上迅速振荡混匀，置于冰上，待所有的样品研磨完。

（3）裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体。对于富含蛋白、脂肪或多糖物质的组织样品如肌肉、脂肪组织和植物结节部位等，匀浆后仍会存留有不溶物质，可于 4℃ 12,000 x g 离心 10 min，然后吸取上清至一新的离心管中。

 

 细胞样本：

（1）贴壁细胞：吸尽培养液，每 10 cm²培养面积（6 孔板单孔或 35 mm 平皿）加入 1 ml TriiZol，用加样器吹打数次，以确保细胞完全裂解，然后转移至离心管中。

注：TriiZol 的使用量应由培养皿表面积决定，而非由细胞数目决定。TriiZol量不足可能导致提取的RNA中有DNA污染 。

（2）悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每5-10×10⁶动植物或酵母细胞，或每1×10⁷细菌细胞加入1ml TriiZol，用加样器吹打，使其完全裂解，然后转移至离心管中。

 注：添加 TriiZol 前切勿洗涤细胞，以免 RNA 降解。必要时可以用匀浆器来裂解某些细菌或者酵母细胞。

 

2．液相分离

（1）裂解产物于室温放置5 min，使核酸-蛋白复合物完全分离。（注：此时样品可在-80℃长期保存。）

（2）每 1 ml TriiZol 加入 0.2 ml 氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡 15 s，室温放置 2-3 min。

（3）4℃ 12,000 × g 离心 15 min，样品会分成三层：桔黄色的下层有机相(蛋白)，中间层（DNA）和无色的上层水相。

（4）吸取含总RNA 的上层水相至一新的离心管中，吸取水相的体积为所用TriiZol试剂的 60％。

注：转移水相时切勿触及中间层，否则可能导致基因组DNA污染

 

3． RNA 回收

（1）按照每 1 ml TriiZol 的最初使用量加入0.5 mL 异丙醇，颠倒数次混匀，室温放置10 min。

（2）4℃ 12,000 × g 离心 10 min，弃除上清，可见胶状的RNA沉淀。

（3）按照每 1 ml TriiZol 的最初使用量加入1 ml 75%乙醇，颠倒数次混匀，洗涤沉淀。

（4）4℃ 12,000 × g 离心 5 min，弃除上清。

（5）室温倒置5-10 min 晾干或真空抽干（不要使用真空干燥离心机，以免RNA过干，难以溶解）。

（6）加入适量（如 25ul）DEPC-ddH₂O 或TE缓冲液，用加样器吹打数次溶解 RNA。

（7）通过 RNA 电泳以及紫外分光光度计检测，确定 RNA 的浓度、纯度和完整性。

（8）所得的 RNA 应立即使用或适量分装后-80℃保存，避免反复冻融。

 

注意事项：

1、如果需要测量 RNA 的 A260/A280 的比值，建议使用RNA定量缓冲液对样品稀释后，进行测量。

2、所有离心管，枪头及相关溶液都必须无 RNA酶污染。耐高温器物可 180℃烘烤 4 小时以去除RNA 酶，其它器物去除 RNA 酶可考虑用 0.01%的 DEPC 水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用 DEPC 水配制。加 0.01% DEPC 至重蒸水或 MiliQ 级水中，处理过夜，灭菌即成 DEPC 水。

3、使用冻存的细胞或组织抽提总 RNA 的效果通常比新鲜的细胞或组织差一些。因为在细胞或组织冻融过程中一些细胞或组织内的 RNase 会被释放出来并剪切样品。如果不能及时抽 RNA， 推荐先加入适量 TriiZol，并裂解样品后冻存。

4、必须戴一次性手套操作，且尽量不要对着 RNA 样品呼气或说话，以防 RNA 酶污染。建议戴一次性口罩操作。

5、TriiZol 含有毒物质苯酚，避免接触皮肤或吸入。为防止溅入眼睛，请戴防护眼镜或使用透明保护屏。如皮肤接触 TriiZol，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。

6、为了您的自身安全，使用试剂前，请做好防护，如穿实验服，带手套等。

 

产品信息

货号	产品名称	规格	引用文献
abs60154	Trizol	100mL/500mL	170篇

 

第二关：逆转录合成cDNA——搭建RNA到qPCR的“桥梁”

 

RNA无法直接用于PCR扩增，逆转录过程就是将RNA模板合成为稳定的cDNA，这一步的效率直接决定了后续定量结果的准确性。选择合适的逆转录试剂盒，并严格控制反应条件，是成功的关键。

 

逆转录一管化三代预混液(abs60246)标准操作PROTOCOL

 

1． 冰上配制如下反应体系： 

试剂	使用量
模板 RNA a	50 ng~1 μg
All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix	4 μl
Nuclease-Free Water	To 20 μl

a. 推荐使用已去除基因组DNA污染的高质量RNA作为模板。

2.轻柔吸打混匀，瞬离；

3.55℃温育 15 min；注：若目标 RNA 不含 Poly(A) 结构，可预先 25℃温育 10 min。

4. 反应结束后，85℃温育 5 min 以终止反应；

5. 将获得的 cDNA 溶液置于冰上，用于后续实验；或立即保存于-20℃。

 

注意事项：

预混液中已经包含 Oligo(dT)20VN 和随机引物，不仅适用于包含Poly(A) 结构的真核生物mRNA，也适用于不含Poly(A) 结构的原核生物 RNA、真核生物rRNA 和 tRNA等模板，但不适用于miRNA 等小RNA模板。

 

产品信息

货号	产品名称	规格
abs60246	逆转录一管化三代预混液	100T

 

同时也推荐使用First-strand cDNA Synthesis Mix With gDNA Remover(abs601510), cDNA第一链合成预混试剂（含去基因组），产品链接：https://www.absin.cn/1-cdna/abs601510?mk_channel=GDHGabsin

 

第三关：荧光定量PCR——精准量化的“终极武器”

 

荧光定量PCR通过实时检测扩增过程中的荧光信号，实现对cDNA的定量分析，是评估基因表达水平的金标准。要获得可靠结果，需兼顾体系配制、程序设置和结果分析三大要点。

 

SYBR Advanced qPCR SuperMix Kit(abs60087)标准操作PROTOCOL

 

一、实验须知：

1. SYBR Advanced qPCR SuperMix Kit是针对两步法反应开发，变性步骤在95℃下进行，退火/延伸综合步骤在60℃下进行，同样适用于Tm低于60℃的引物；

2. 为确保采用SYBR Green进行Real-Time PCR时具有最高效率，产物长度建议为60-200bp；

3. PCR反应时必须先进行热启动步骤，即在95℃下孵育2min，激活热启动DNA Polymerase；

4. 对于96孔模块PCR仪，建议的反应物终体积为20μL。对384孔模块PCR仪，建议的反应物终体积为10μL。

 

二、操作步骤：

1. 将2×SYBR Advanced qPCR SuperMix、模板gDNA或cDNA、引物、ROX Reference Dye（根据需要）以及RNase-Free Water解冻并混匀，根据下表制备反应混合液。由于存在热启动机制，构建反应或设置实时定量PCR仪时，无需将样品一直放置在冰上。

 

组分	96孔模块(加入量)	384孔模块(加入量)	终浓度
2×SYBR Advanced qPCR SuperMix	10 μL	5 μL	1×
ROX Reference Dye(需要时加入)	2 μL/0.1 μL	1 μL/0.05 μL	1×
正向引物	可变	可变	0.7 μM
反向引物	可变	可变	0.7 μM
DNA 模板	可变	可变	≤100 ng/次
RNase-Free Water	To 20 μL	To 10 μL	—

2. 充分混匀反应混合物，并取适当体积加入PCR管或反应板中。

3. 将模板gDNA或cDNA（≤100ng/次）加入含有反应混合液的各个PCR管或孔中。对于两步法RT-PCR，加入的cDNA（未稀释的反转录反应物）体积不能超过PCR终体积的10%。

4. 根据下表中列出的程序设置实时定量PCR仪。应在进行退火 / 延伸步骤时收集数据。

步骤	温度	时间	升降温速率	循环数	补充说明
PCR 热启动	95℃	2min	最大/快速模式	—	加热活化DNA聚合酶
变性	95℃	5sec	最大/快速模式	35-40 Cycles*3	—
退火/延伸	60℃*2	10sec*1	最大/快速模式		收集荧光数据

 

*注意：

1、熔解曲线分析是实时定量 PCR 仪软件内置的一项分析步骤。进行此分析时，须遵守仪器提供的说明。

2、如果 PCR 仪无法在这么短的时间内完成数据采集，则以仪器采集数据所需的最短时为准。

3、该温度也同样适用于所有Tm低于60℃的引物。

4、循环数取决于模板DNA的量。

5、将 PCR 管或反应板放置在实时定量PCR仪上并启动PCR程序。

6、对 PCR 产物进行熔解曲线分析。

此项分析功能已内置于实时定量 PCR 仪的软件中，我们强烈建议您定期进行此项分析以验证 PCR 产物的特异性。

 

技术指标：

ROX Reference Dye可加入到2×SYBR Advanced qPCR SuperMix中以便长期储存。

2×SYBR Advanced qPCR SuperMix	高ROX浓度/低ROX浓度(加入的ROX Reference Dye体积)
1.7mL	340μL/17μL

高ROX Reference Dye机型：ABI Prism7000/7300/7700/7900HT/ 7900HT Fast和ABI Step One /ABI StepOne Plus等；

低ROX Reference Dye机型：ABI Prism7500/7500 Fast/ViiA7/ QuantStudio 3/5/6 /7, Stratagene MX4000/MX3005P/MX3000P系列，MJ Research Chromo4，Opticon (II) ，Corbett Rotor Gene 3000等；

无需加ROX Reference Dye机型：Thermal Cycler Dice Real Time System，Corbett Rotor-gene6000，Bio-Rad CFX系列，Roche LightCycler® 480，Qiagen Rotor-Gene Q，Analytik Jena qTOWER系列等。

 

产品信息

货号	产品名称	规格
abs60087	SYBR Advanced qPCR SuperMix Kit	100T

RNA表达研究的成功，离不开三件套的环环相扣：TriiZol提取的高质量RNA是基础，逆转录的高效转化是桥梁，荧光定量的精准扩增是核心。掌握了这套TriiZol +逆转录+荧光定量的操作指南和注意事项，你就能轻松应对RNA表达分析中的各种难题。一套靠谱的试剂组合+规范的操作流程，就是你科研路上的“神队友”，帮你高效获得可靠数据，加速科研成果落地！

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