NK-92细胞培养SOP及注意事项

NK?92为人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞，属于IL?2依赖型NK细胞系。是NK细胞功能研究、CAR?NK工程化改造及免疫治疗机制探索的常用悬浮模式细胞，细胞聚团生长，边缘清晰、折光性强。细胞增殖依赖重组IL?2，缺少IL?2的细胞会在72?h内死亡。本文将针对NK?92的细胞培养流程进行梳理和指导。

一、细胞复苏

1.【准备工作】水浴锅提前预热至37℃；9mL完全培养基37℃预热；生物安全柜紫外照射灭菌30min；

2.【融化】液氮取出冻存管，37℃水浴快速摇晃融化，约1?2min

3.【稀释】75%酒精擦拭冻存管外壁，移入生物安全柜开盖，细胞悬液缓慢滴入装有9mL预热完全培养基的15mL离心管，轻轻吹打均匀；

4.【转移】取全新10cm培养皿，皿盖标注细胞名称、传代人、代数、日期，将细胞悬液转移至培养皿；

5【培养】放入37℃、5% CO?培养箱静置培养。

注意：复苏时尽量避免离心。

二、细胞传代

1.【实验准备】配制完全培养基：MEM?α培养基（abs9506-500ml）+0.2 mM 肌醇（abs47001670-20mg）+0.1 mM β?巯基乙醇（abs9592-100ml）+0.02 mM 叶酸（abs812845-100mg）100?200 U/mL重组人IL?2（abs00804-10ug）+12.5% HS（abs989-125ml）+12.5% FBS（abs972-500ml）+1% P/S（abs9244-100ml）；提前取出PBS（abs962-500ml）、完全培养基，恢复至室温；生物安全柜提前使用紫外照射30min。

注意：完全培养基，建议现配现用，最多4℃保存不超过2周。

注意：传代过程中所有试剂均需要恢复至室温。

2.【镜检】在显微镜下观察细胞，细胞团较多且大，培养基颜色轻微变黄时即可进行传代；

3.【细胞收集】将所有细胞悬液收集至15mL离心管中；

4.【静置】静置一段时间，使得细胞团自然沉降；弃掉旧培养液，缓慢加入2?3mL新培养液，轻轻吹打，将大细胞团分散成小细胞团；

注意：该细胞不建议离心。

注意：该细胞对机械吹打高度敏感，严禁大力、反复吹打。

5.【传代】准备一个新的10cm培养皿，在皿盖上标注细胞名称、传代人、代数、日期。加入9mL完全培养基，再加入1mL细胞悬液，十字轻晃混匀；

注意：该细胞传代比例建议为1:2?1:3，可根据传代比例加入适量完全培养基；

6.【镜检】显微镜下确认细胞分散均匀后，放入37℃、5%CO?培养箱观察培养。

三、细胞冻存

1.【准备工作】细胞冻存液可使用无血清细胞冻存液（abs9417-100mL），也可以自行配制：90%FBS（abs972-500ml）+10%DMSO（abs9187-100mL）。存管提前标注：细胞名称、代数、冻存人、冻存日期。生物安全柜提前使用紫外照射30min；

注意：单个皿可冻存2?3只，建议冻存时提高密度。

2.【细胞收集】细胞团较多且大时，按照传代步骤进行细胞收集；

3.【细胞重悬】加入2mL细胞冻存液，轻轻吹打重悬细胞；

4.【冻存】每管加入1mL混合液至冻存管中，将冻存管放入冻存盒中，放入?80℃冰箱，过夜后转移至液氮罐中。

四、关键注意事项

1. 操作注意：

（1）除极端情况，日常换液和传代优先使用“自然沉降法”；

（2）NK?92非常脆弱，所有操作都要极其轻柔，避免剧烈吹打、震荡和离心；

（3）细胞团过大时，才用移液管轻柔吹打2?3次成小团，切忌吹打成单细胞悬液；

（4）传代次数不要超过20代，超过后细胞的杀伤活性和增殖能力会显著下降。

2. 血清选择：

细胞非常脆弱，推荐使用优级血清培养。

3. 培养基配制&保存：

建议现配现用，配好的培养基保存不超过2周，IL?2请勿反复冻融。

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